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http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/16184
Tipo do documento: | Tese |
Título: | Glutationa S-transferase do cérebro de pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) em diferentes tensões de oxigênio |
Título(s) alternativo(s): | Glutathione S-transferase from brain of pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) inder different oxygen pressure |
Autor: | Leitão, Santiago Alonso Tobar ![]() |
Primeiro orientador: | Bastos, Vera Lucia Freire da Cunha |
Primeiro coorientador: | Bastos Neto, Jayme da Cunha |
Primeiro membro da banca: | Bezerra, Leila Maria Lopes |
Segundo membro da banca: | Bianchini, Adalto |
Terceiro membro da banca: | Silva, Wagner Seixas da |
Resumo: | No pantanal ocorre o pulso de inundação, fenômeno que provoca esgotamento sazonal e diário do oxigênio na água de rios e bacias. Variação do oxigênio dissolvido faz mudar a disponibilidade de oxigênio para as mitocôndrias, o que resulta em redução parcial do oxigênio nas células. Se moléculas de oxigênio não são inteiramente reduzidas até H2O, íons de oxigênio conhecidos como espécies reativas de oxigênio (ERO) podem escapar da cadeia respiratória. ERO são potentes oxidantes, o que os torna danosos para a vida em concentrações elevadas. Desde que o pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887), é uma espécie de peixe que suportou grandes variações da concentração de oxigênio por toda a sua evolução no Pantanal, nós decidimos pesquisar para saber se existem atividades enzimáticas antioxidantes capazes de neutralizar as ERO em seus órgãos. Material e Métodos: Neste trabalho purificamos GST do cérebro de pacus em normoxia e hipóxia por cromatografia de afinidade à partícula MagneGSTTM. A fração purificada foi separada por eletroforese em gel de poliacrilamida e em seguida os ensaios cinéticos foram realizados com os substratos eletrofílico CDNB e 4-HNE. Para caracterizar a proteínas presentes na fração purificada foi realizada uma eletroforese bidimensional cujos spots foram recortados e analisados em espectrômetro de massa (MALDI ToF-ToF). Resultados: A separação por SDS-PAGE da fração purificada mostrou duas bandas de proteínas nos cérebros de pacus em normoxia e três nos pacus em hipóxia. Essas proteínas retêm aproximadamente 60% da atividade total de GST medida na fração citosólica em ambos os grupos. O ensaio cinético da fração purificada mostrou pequenas variações nos valores de Vmax e KM, resultado que sugere a presença de diferentes isoenzimas de GST. Além do mais, as variações não apresentaram o mesmo perfil entre as frações purificadas dos grupos normoxia e hipóxia, portanto é possível que o conjunto de isoenzimas presentes seja diferente em cada condição. Os resultados da eletroforese com focalização isoelétrica do grupo normoxia apresentou 14 spots com pontos isoelétricos entre 5,9 - 9,0. Já o grupo hipóxia mostrou 8 spots com pontos isoelétricos entre 6,5 -9,47. Apenas um spot de proteína do grupo hipóxia não é comum ao grupo normoxia. A análise da sequência primária mostrou uma sequência de 11 aminoácidos com 100% de similaridade com a GSTP1 do Salmo Salar. Conclusões: O conjunto de dados obtidos sugere que a atividade de GST encontrada possa contribuir para a sobrevivência do Pacu às variações de oxigênio que ocorrem no Pantanal. É possível que a GSTP1 tenha papel crucial nessa resistência. |
Abstract: | In Pantanal occurs the inundation pulse, a phenomenon that provokes seasonal and circadian oxygen depletion in water of rivers and bacias . Variation of dissolved oxygen alternates the oxygen availability to mitochondria, which results in partial reduction of oxygen in cells. Whether oxygen molecules are not fully reduced to H2O, oxygen ions known as reactive oxygen species (ROS) can escape from the respiratory chain. ROS are strong oxidant, which make them harmful to life in high concentrations. Since pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887), is a fish species that has endured large variation of oxygen concentration all along its evolution in Pantanal, we have decided to research to find out whether there are antioxidant enzymatic activities capable of quenching ROS in its organs. Material and methods: In this work GST from brains of pacus subjected to normoxia and hypoxia were purified with MagneGSTTM particle by affinity chromatography. Purified fraction was separated in polyacrylamide gel electrophoresis then the kinetic assays were performed using the electrophilic substrates CDNB and 4-HNE. In order to characterize the proteins presents in the purified fraction a two-dimension electrophoresis was conducted and the showed up spots were cut-off and analyzed in mass-spectrophotometer (MALDI ToF-ToF). Results: SDS-PAGE of the purified fraction from brains of pacus showed two protein bands in normoxia group and three bands in the hypoxic group. The remaining activity of the purified fraction, in both groups was about 60% when compared to the total activity found in the cytosolic fraction. Kinetics studies revealed little differences in Vmax and KM values which suggest the participation of several GST isoenzymes. Furthermore, comparison between normoxia and hypoxic kinetics parameters showed different behavior, so it is plausible that GST pool from the normoxia purified fraction are slightly different from the hypoxic group. The results of two-dimensional electrophoresis showed 14 spots with isoelectric points range from 5.9 to 9.0 in normoxia group while the hypoxic group showed 8 spots with isoelectric point range from 6.5 to 9.47. Only one spot of hypoxia group was not shared with the normoxia group. The primary sequence analysis showed 11 amino acids with 100% homology with GSTP1 from Salmo Salar. Conclusions: The whole results suggest that GST activity found in pacu brain may help them to overcome the oxygen depletion that occur circadian and seasonally. Additionally, the GSTP1 may have a crucial role in their survival. |
Palavras-chave: | Pantanal Oxidative stress Glutathione S-transferase Pantanal Estresse oxidante Glutationa S-transferase Pacu (Peixe) Pantanal Mato-grossense (MS e MT) Glutationa S-Transferase pi Estresse oxidativo |
Área(s) do CNPq: | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA |
Idioma: | por |
País: | BR |
Instituição: | Universidade do Estado do Rio de Janeiro |
Sigla da instituição: | UERJ |
Departamento: | Centro Biomédico::Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes |
Programa: | Programa de Pós-Graduação em Biociências |
Citação: | LEITÃO, Santiago Alonso Tobar. Glutationa S-transferase do cérebro de pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) em diferentes tensões de oxigênio. 2013. 90 f. Tese (Doutorado em Biociências) - Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013. |
Tipo de acesso: | Acesso Aberto |
URI: | http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/16184 |
Data de defesa: | 6-Mar-2013 |
Aparece nas coleções: | Doutorado em Biociências |
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Tese - Santiago Alonso Tobar Leitao - 2013 - Completa.pdf | 1,66 MB | Adobe PDF | Baixar/Abrir Pré-Visualizar |
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