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Tipo do documento: Dissertação
Título: Captura e ativação de plasminogênio por Pseudomonas aeruginosa
Título(s) alternativo(s): Binding and activation of plasminogen to Pseudomonas aeruginosa
Autor: Silva, Cecilia Maria Ferreira da 
Primeiro orientador: Plotkowski, Maria Cristina Maciel
Primeiro membro da banca: Andrade, João Ramos da Costa
Segundo membro da banca: Suasssuna, José Hermogenes Rocco
Terceiro membro da banca: Passolani, Maria Cristina Vidal
Resumo: A afinidade pelo plasminogênio (Plg) por cepas de Pseudomonas aeruginosa laboratoriais e clínicas, isoladas de sangue e de fezes de indivíduos assintomáticos, foi avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA). A ligação de Plg a poços de microplacas de ELISA revestidas com os inóculos bacterianos foi significativamente superior à ligação a poços controle não revestidos (p<0.001). Nenhuma diferença significativa foi observada entre a captura de Plg pelas cepas de sangue ou de fezes, o que sugere a presença de receptores de superfície para Plg seja constitutiva. A ligação do Plg à cepa fimbriada PAK e à sua mutante isogênica não fimbriada PAK/p- foi semelhante, sugerindo que as fímbrias do tipo IV não sejam relevantes na captura de Plg . A adição de ácido --aminocapróico aos testes reduziu significativamente (p<0.001) a captura de Plg pelas cepas PAK e PAK/p-, evidenciando que a ligação do zimogênio aos receptores bacterianos é lisina-dependente e sugerindo a importância dos domínios “kringle” na ligação da molécula aos micro-organismos. A participação de ompitinas na captura de Plg por P. aeruginosa foi pesquisada pela técnica de Western-blotting. Todas as 14 cepas estudadas apresentaram frações proteicas, com pesos moleculares entre 30 e 60 kDa, capazes de ligar Plg com alta especificidade. A capacidade de ativação do Plg associado às células bacterianas foi pesquisada pelo tratamento dos micro-organismos aderidos a poços de microplacas de ELISA com Plg, ativador uroquinase (u-PA) e com o substrato cromogênico da plasmina. Em paralelo, poços contendo bactérias aderidas foram tratados apenas com Plg e com o substrato cromogênico, para avaliação da capacidade intrínseca dos micro-organsimos de gerar plasmina. As 14 cepas estudadas apresentaram variável capacidade de degradação do substrato, em presença de u-PA. Duas cepas, uma isolada de fezes e a outra de sangue, apresentaram capacidade significativamente superior à das demais em degradar o substrato, inclusive independentemente da presença de u-PA, sugerindo a existência de um ativador endógeno ligado ao corpo bacteriano. Os resultados de ensaios preliminares sugeriram que este ativador seja uma serino-protease uma vez que não pode ser inibido pela adição de EDTA aos testes. Finalmente, foi pesquisado o efeito da captura e ativação de Plg na capacidade proteolítica de P. aeruginosa e, consequentemente, em seu potencial de invasão. Géis de fibrina contidos em tubos de Durhan ou em insertos Millicell-PCF foram expostos a suspensões bacterianas tratadas com plasmina. Como controle, outros géis foram expostos a bactérias não tratadas com plasmina. Nos dois modelos experimentais, a presença da plasmina conferiu maior invasividade aos micro-organismos, detectada em 3 horas. Com base nos resultados obtidos, sugerimos que, in vivo, a captura do Plg e sua ativação possam favorecer a degradação de barreiras teciduais do hospedeiro, como coágulos e membranas basais, e à disseminação bacteriana, no curso de processos infecciosos invasivos por P. aeruginosa.
Abstract: This study was carried out to assess the affinity for plasminogen (Plg) by ELISA of Pseudomonas aeruginosa laboratory and clinical strains isolated from blood of septicemic patients or from stools of asymptomatic carriers. The Plg binding to ELISA microplate coated wells with 14 different bacterial strains was significantly higher (p<0.001) than the binding to uncoated control wells. The Plg binding by blood strains did not differ from the binding by stool strains, suggesting that the expression of Plg receptors on P. aeruginosa surface is constitutive. No difference in the Plg binding was detected between the piliated PAK strain and the isogeneic nonpiliated mutant PAK/p-, suggesting that type IV pili is not a main adhesin accountig for Plg binding to P. aeruginosa cells. The inclusion of ε-aminocaproic acid in the assays reduced significantly the Plg binding to PAK and PAK/p- strains indicating that Plg binding to surface P. aeruginosa receptors is lysin dependent and suggesting a role for the kringle domains in the Plg capture by bacterial cells. By Western-immunoblotting assays, several P. aeruginosa low molecular weight outer membrane proteins (from 30 to 60 kDa) were seen to react with Plg, suggesting that P.aeruginosa Plg surface receptors are omptins.To ascertain whether bacteria-bound Plg could be activated to plasmin, bacteria-coated microplate wells were incubated successively with Plg and with the urokinase (u-PA) activator. The bacteria- associated proteolytic activity was assessed by the addition of a chromogenic plasmin substrate. In parallel, other bacteria-coated microplate wells were exposed only to Plg and to the chromogenic substrate, to assess the intrinsic capability of the bacteria to generate plasmin. Most strains were shown to activate Plg in plasmin in presence of u-PA. Two clinical strains, one from blood and the other from stools, exhibited a marked capability to generate plasmin in the absence of u-PA, suggesting the existence of an endogenous cell surface Plg activator. The results from preliminary studies carried out in the presence of EDTA suggest that this P. aeruginosa Plg activator is a bacteria-bound serine protease. Finally, the role of Plg binding and activation to plasmin in the bacterial proteolytic activity and invasiveness was assessed by inoculating fibrin gels prepared in Durhan tubes or in Millicell inserts with plasmin-coated and uncoated bacteria. The presence of surface-bound plasmin enhanced significantly the P. aeruginosa capacity to invade the fibrin gells, detected as early as 3h after the infection. Based on these results, we suggest that in vivo, the binding of Plg to P. aeruginosa surface may represent a mechanism that could enhance the bacterial metastasis through normal host tissue barriers, such as fibrin clots and basal membranes, in the course of invasive infectious processe.
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa
Plasminogen binding and activation
Bacterial plasminogen activators
Bacterial metastasis
Pseudomonas aeruginosa
Captura e ativação de plasminogênio
Ativadores bacterianos de plasminogênio
Metástase bacteriana
Área(s) do CNPq: CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Sigla da instituição: UERJ
Departamento: Centro Biomédico::Faculdade de Ciências Médicas
Programa: Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Citação: SILVA, Cecilia Maria Ferreira da. Captura e ativação de plasminogênio por Pseudomonas aeruginosa. 2002. 82 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2002.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/18170
Data de defesa: 23-Set-2002
Aparece nas coleções:Mestrado em Microbiologia

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