Compartilhamento |
![]() ![]() |
Use este identificador para citar ou linkar para este item:
http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/18242
Tipo do documento: | Tese |
Título: | Propriedades fenotípicas e moleculares associadas aos aspectos evolutivos de Enterococcus faecium: análise comparativa de estratégias de um patógeno oportunista |
Título(s) alternativo(s): | Phenotypic and molecular properties associated with evolutionary aspects of Enterococcusfaecium: comparative analysis of the strategies of an opportunistic pathogen |
Autor: | Silva, Beatriz Nascimento Monteiro da ![]() |
Primeiro orientador: | Merquior, Vânia Lúcia Carreira |
Segundo orientador: | Teixeira, Lúcia Martins |
Primeiro coorientador: | Manfro, Wânia Ferraz Pereira |
Primeiro membro da banca: | Valente, Raphael do Carmo |
Segundo membro da banca: | Ferreira, Alex Guerra |
Terceiro membro da banca: | Costa, Giovani Carlo Veríssimo da |
Resumo: | Enterococcus faecium se destaca como uma espécie bacteriana frequentemente multirresistente aos antimicrobianos, associada à infecções hospitalares em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi investigar comparativamente as características de duas amostras de E. faecium: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (amostra clínica proveniente de infecção urinária de origem hospitalar). Estas amostras foram caracterizadas quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos, presença de determinantes genéticos de resistência e de virulência e métodos de tipagem molecular PFGE, MLVA e MLST. Foi também avaliada a capacidade de formação de biofilmes e as características associadas a sua arquitetura, por microscopia confocal a laser (CLSM). A resposta de macrófagos da linhagem J.774 às células planctônicas e aos biofilmes foi identificada por quantificação das citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-6 e IL-10 (através de ensaio imunoenzimático), dosagem de óxido nítrico e CLSM. Avaliações por ESI-Q-TOF foram empregadas para determinação do perfil proteômico de biofilmes e do crescimento planctônico, a partir de resultados prévios obtidos por SDS-PAGE. Foi também realizado o sequenciamento do genoma completo (WGS) da amostra clínica CL-6729 com auxílio da plataforma Illumina Hiseq e anotação dos genes pela PATRIC 3.2.75.Nossos resultados demonstraram que CL-6729 é multirresistente e alberga os genes vanAe esp; é pertencente ao MT-12 e ao ST-78, consequentemente faz parte do complexo clonal 17 (CC17). Esta amostra apresentou resistência constitutiva à vancomicina. Análises da integridade do Tn1546 revelaram a presença de IS19 inserida no gene vanS. Pela reunião de dados obtidos por qPCR e sequenciamento parcial dos genes envolvidos, a presença de IS19 parece estar influenciando direta ou indiretamente na alteração da expressão da resistência. A expressão constitutiva da resistência à vancomicina foi detectada tanto para o cultivo planctônico como em biofilmes. Biofilmes de E. faecium apresentaram biomassa rica em proteína após 24 h de incubação e em DNA após 72 h. Dados relativos à interação por 24 h de CL-6729 macrófagos J.774 demonstraram uma modulação negativa da produção de nitrito pelos macrófagos. Por outro lado, em relação ao estímulo à produção de citocinas, os dados sugerem uma indução na produção das citocinas, TNF-α, IFN-, IL-6 e IL-10, tanto por biofilmes quanto células planctônicas de ambas as amostras bacterianas. Além disso, CLSM revelou que macrófagos são capazes de penetrar na estrutura dos biofilmes. Os resultados relativos à espectrometria de massa sugerem que células de biofilmes de E. faeciumparecem estar ativas, diante da identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular. Análises por WGS revelaram um tamanho de 2,9 Mb, com 3.125 genes preditos, dentre os quais cerca de 2.000 genes estão associados ao metabolismo de carboidratos e de ácidos núcleicos e à divisão celular. Foram anotados genes associados à resistência aos antimicrobianos, virulência, sequências de inserção, fagos e plasmídeos. Nossos dados apontam para um processo evolutivo dinâmico e especializado, que indica alterações significativas entre amostras de uma mesma espécie. Tais alterações demonstram capacitar esta espécie, anteriormente identificada como patógeno de baixo potencial de virulência, ao status de um microrganismo capaz de atingir gravemente a saúde humana. Consideramos que nossos resultados agregam informações que reafirmam a necessidade do acompanhamento contínuo das infecções causadas por microrganismos desta espécie, diante de suas habilidades de adaptação e persistência. |
Abstract: | Enterococcus faecium stands out as a bacterial species that have been often associated with hospital-acquired infections around the world. The aim of this study was to compare the characteristics of two E. faecium strains SS-1274 (type strain) and CL-6729 (clinical isolate from nosocomial urinary tract infection). The bacterial strains were characterized by antimicrobial susceptibilities, presence of genetic determinants of virulence and resistance and molecular typing methods as PFGE, MLVA, and MLST. It was also evaluated the biofilm formation and architecture by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The response of macrophages J.774 to biofilms and planktonic growth was identified by enzyme-linked immunosorbent assay quantification of cytokines TNF-α, IFN-γ, IL-6 and IL-10, determination of nitric oxide concentration and CLSM. Proteomic profiles of the bacterial cells from biofilms and planktonic growth were carried out by ESI-Q-TOF mass spectrometry methodology from prior results achieved by SDS-PAGE. It was also investigated the whole genome sequencing (WGS) of CL-6729 using Illumina Hiseq platform and genes annotation was performed on PATRIC 3.2.75. Our results showed that CL-6729 is multi-drug resistant and harbored the genes vanA and esp. This isolated was molecular typed as MT-12 and ST-78, therefore belonging to the clonal complex 17 (CC17). This isolate also showed constitutive resistance to vancomycin, an unusual characteristic for the species. Analysis of Tn1546 revealed the presence of IS19 inserted into the gene vanS. According to the data obtained from qPCR and partial sequencing of the genes involved with vancomycin resistance, the presence of IS19 seemed to be influencing directly or indirectly on the changes of the resistance mechanisms expression as was identified from both biofilms and planktonic growing. Biofilms of E. faecium showed protein-rich and DNA-rich biomass after 24 h and 72 h of formation, respectively. Interaction assays demonstrated a negative modulation of nitrite production by macrophages J.774. On the other hand, the data suggest ainduction of cytokines production, TNF-α, IFN-, IL-6 e IL-10, by biofilms and planktonic cells from both E. faecium strains. In addition, CLSM has shown that macrophages were able to penetrate the biofilms structure. The results relating to mass spectrometry suggest that biofilm cells of E. faecium had seemed to be metabolicaly active, according to the identification of a significant number of proteins related to metabolism and cell division. WGS revealed a 2.9 Mb size, with 3,125 predicted genes, among which about 2,000 genes are associated with the carbohydrates and nucleic acids metabolisms, and cell division. Genes associated with antimicrobial resistance, virulence, insertion sequences, phage and plasmids were annotated. Our data point to a dynamic and evolutionary process, indicating significant changes between samples of the same species. These data highlights the continuous evolution process of this species that changes the concept from an ordinary opportunistic pathogen with low virulence potential to a severely problem to human health. We believe that our results reaffirm the need of continuous monitoring the infections caused by these microorganisms, considering their skills of adaptation and persistence. |
Palavras-chave: | Enterococcus faecium Biofilmes Virulência Tn1546 Diversidade genética Genoma E. faecium Enterococcus faecium Biofilms Virulence Tn1546 Genetic diversity.E. faecium whole-genome sequence Extracellular vesicles |
Área(s) do CNPq: | CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA |
Idioma: | por |
País: | Brasil |
Instituição: | Universidade do Estado do Rio de Janeiro |
Sigla da instituição: | UERJ |
Departamento: | Centro Biomédico::Faculdade de Ciências Médicas |
Programa: | Programa de Pós-Graduação em Microbiologia |
Citação: | SILVA, Beatriz Nascimento Monteiro da. Propriedades fenotípicas e moleculares associadas aos aspectos evolutivos de Enterococcus faecium: análise comparativa de estratégias de um patógeno oportunista. 2017. 153 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) - Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017. |
Tipo de acesso: | Acesso Aberto |
URI: | http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/18242 |
Data de defesa: | 11-Mai-2017 |
Aparece nas coleções: | Doutorado em Microbiologia |
Arquivos associados a este item:
Arquivo | Descrição | Tamanho | Formato | |
---|---|---|---|---|
Tese - Beatriz Nascimento Monteiro da Silva - 2017 - Completa | 3,09 MB | Adobe PDF | Baixar/Abrir Pré-Visualizar |
Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.