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Tipo do documento: Dissertação
Título: Caracterização das células-tronco mesenquimais de medula óssea humana de pacientes com osteoartrite purificadas por adesão diferencial
Título(s) alternativo(s): Mesenchymal stem cell purification and characterization from osteoarthritic
Autor: Claudino, Gustavo Paris 
Primeiro orientador: Thole, Alessandra Alves
Primeiro membro da banca: Carvalho, Simone Nunes de
Segundo membro da banca: Galvani, Rômulo Gonçalves
Resumo: Células-tronco mesenquimais (CTM) de medula óssea apresentam grande potencial terapêutico devido a sua multipotencialidade e propriedades imunoreguladoras e anti-apoptóticas. Entretanto, a heterogeneidade marcante presente na população denominada como CTM, uma vez que são isoladas e identificadas por sua capacidade de adesão ao plástico, aliada à ausência de marcadores precisos para caracterizá-las, dificulta a purificação das células multipotentes. Como a célula mais indiferenciada resguarda maior potencial proliferativo e de diferenciação, o presente estudo propõe um protocolo de isolamento de CTM de medula óssea adesão-dependente, com cultivo do sobrenadante normalmente descartado após 3 dias, identificadas como CTM de adesão lenta (CTM-AL). Os resultados demonstraram que as CTM-AL apresentaram maiores colônias primárias, além de maior frequência e tamanho de colônias secundárias que a população de CTM isolada pelo método padrão-ouro, de adesão rápida (CTM-AR). Além disso, quando diferenciadas nas linhagens adipogênica e osteogênica, as CTM-AL demonstraram maior capacidade de diferenciação adipogênica que as CTM-AR, enquanto mantiveram a mesma capacidade de diferenciação osteogênica. Na caracterização por citometria, as células de ambas as populações apresentaram, majoritariamente, o fenótipo CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD29+/CD44+. As CTM-AR apresentaram maior frequência de células CD45+, HLA+ e CD184+, enquanto as CTM-AL mostraram-se enriquecida em células CD24+, CD49d+ e CD146+. Além da frequência, a intensidade de fluorescência de células CD146+ também foi maior em CTM-AL. Ademais, -actina de músculo liso foi detectada nas células de ambas as populações. Como a presença de CD146 e -actina de músculo liso está fortemente correlacionada com a posição anatômica perivascular, aonde CTM indiferenciadas se localizam, seu papel na formação e desenvolvimento de vasos endoteliais foi avaliado. Células endoteliais da microvasculatura humana (HMEC)-GFP+ foram co-cultivadas em matrigel com CTM-AR ou CTM-AL PKH26red+ (5:1), por 72 horas. Durante todo o experimento, observamos CTM-AR e CTM-AL adjacentes aos túbulos formados, de maneira abluminal. Em ambos os co-cultivos houve uma ação inibitória da formação de vasos durante 72 horas. Dessa forma, as CTM-AL referem-se à população com maior capacidade proliferativa, menor grau de contaminação celular (CD45+/HLA+) e enriquecida em células CD146+. Além disso, as CTM-AL são capazes de organizar e estabilizar rede tubular endotelial, mostrando perfil semelhante a pericito. Assim, utilizando o protocolo aqui proposto, purificamos uma população de CTM com perfil perivascular, mais indiferenciadas. Futuras investigações determinarão o potencial terapêutico e a identificação do fenótipo preciso das CTM multipotentes.
Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) have been thoroughly explored due to its therapeutic effects as multipotent, immunosuppressing and anti-apoptotic cells. However, since MSC are isolated and identified from marrow cells using plastic adhesion and precise cell markers are absent, marked heterogeneity persists in the so-called MSC population. Therefore, progenitors and differentiated cells are mixed in MSC population, hampering true multipotent MSC isolation and characterization. The present study proposes an adhesion-based protocol to isolate bone marrow MSC by culturing the commonly discarded supernatant after 3 days culture, named here as late-adhesion MSC (MSC-LA). MSC-LA formed larger primary colonies, in addition to larger secondary colonies and frequency than the standard isolation protocol (MSC-RA). Besides, MSC-LA displayed clearly more adipogenic capacity while maintaining equal osteogenic potential as MSC-RA. In cytometry characterization, most cells presented the CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD29+/CD44+ phenotype for both populations. While MSC-RA showed greater CD45+, HLA+ and CD184+ cells, MSC-LA displayed enhanced purity in CD24+, CD49d+ and CD146+ cells. Also, CD146+ MSC-LA cells also had higher median fluorescent intensity. Moreover, smooth muscle -actin was present in cells from both populations. Since CD146+ and smooth muscle -actin+ are highly correlated to perivascular cells, which are enriched for undifferentiated MSC, we sought to define their role in vessel formation and development. Human microvascular endothelial cells-GFP+ were co-cultivated in matrigel with MSC-AR or MSC-AL PKH26red+ (5:1), for 72hours. Throughout the whole experiment, both MSCs were observed surrounding vessels at the abluminal side in tight proximity to endothelial cells. Both MSC populations induced anti-angiogenic effects during 72 hours. Therefore, a higher proliferation potential, less CD45+ and HLA+ contamination while enriched for CD146+ cells was seen in the MSC-LA group. As noted, MSC-LA is capable of regulating and stabilizing the endothelial vessels. Thus, MSC-LA correlates to a perivascular MSC population, which presents more undifferentiated characteristics, confirming enhanced purity obtained by the adhesion-based protocol. Future work will determine the therapeutic potential and precise phenotype for primitive MSC.
Palavras-chave: Mesenchymal stem cells
Purification
Perivascular
Adhesion
CD146
Célula-tronco mesenquimal
Purificação
Adesão
Perivascular
CD146
Células-tronco
Células-Tronco Mesenquimais
Osteoartrite
Área(s) do CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MORFOLOGIA
Idioma: por
País: BR
Instituição: Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Sigla da instituição: UERJ
Departamento: Centro Biomédico::Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes
Programa: Programa de Pós-Graduação em Biologia Humana e Experimental
Citação: CLAUDINO, Gustavo Paris. Caracterização das células-tronco mesenquimais de medula óssea humana de pacientes com osteoartrite purificadas por adesão diferencial. 2019. 85 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Humana e Experimental) - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2019.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/7807
Data de defesa: 28-Mai-2019
Aparece nas coleções:Mestrado em Biologia Humana e Experimental

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